声明

本文是学习GB-T 35029-2018 基于微阵列芯片的遗传性耳聋基因检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们

1 范围

本标准规定了基于微阵列芯片的常见遗传性耳聋基因检测的操作方法。

本标准适用于临床辅助诊断、新生儿筛查、流行病学调查、健康人筛查等领域常见的遗传性耳聋相

关基因位点的检测。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 27990—2011 生物芯片基本术语

YY/T 1153 体外诊断用DNA 微阵列芯片

YY/T 1154 激光共聚焦扫描仪

3 术语和定义

GB/T 27990—2011界定的术语和定义适用于本文件。

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

dATP: 脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

dCTP: 脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)

dTTP: 脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)

GJB2: 缝隙连接蛋白β亚基2(gap junction beta 2)

GJB3: 缝隙连接蛋白β亚基3(gap junction beta 3)

PCR: 聚合酶链式扩增(polymerase chain reaction)

SDS: 十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)

SLC26A4: 溶质转运蛋白26成员4(solute carrier family 26,member 4)

SSC: 柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer solution)

5 原理

根据现已发现并基于我国人群聋病流行病学调查确证的遗传性耳聋基因突变位点信息，采用多重

扩增及芯片杂交技术对中国人群中常见的遗传性耳聋基因突变位点进行检测。

GB/T 35029—2018

以人基因组 DNA
为模板，采用合适引物对相关基因位点所在基因片段进行扩增和荧光标记，然后
依据碱基互补配对原则，与能够识别该序列的基因芯片进行杂交，最后进行芯片扫描和数据分析。由于
针对所检测的多个位点的野生型和突变型分别设计了引物和探针，因此可以同时检测出多个位点的野

生型和突变型结果。

6 材料

6.1 仪器设备

符合 YY/T1154
要求并获得医疗器械注册证书的微阵列芯片扫描仪、核酸微量离心机、离心管、恒
温摇床、芯片洗干仪(备选)、微量加样器及加样器吸头、微量离心机、离心管、恒温摇床、芯片洗涤容

器等。

6.2 试剂

本方法中需要的试剂可以是单独的试剂，也可以是已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒中的

试剂。

6.2.1 水

本方法中所用水为 GB/T 6682 规定的三级水。

6.2.2 引物、探针

针对检测位点设计针对各位点相应的上游引物和下游引物，以及针对各位点的检测探针，常见的遗

传性耳聋相关基因位点应包括表1中的基因位点及突变形式。

表 1 常见遗传性耳聋相关基因位点

GB/T 35029—2018

6.2.3 Taq DNA 聚合酶缓冲液

分子生物学级

6.2.4 dNTP 溶液

包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的混合物。

6.2.5 MgCl₂ 溶液

分子生物学级。

6.2.6 Taq DNA 聚合酶

本方法中宜采用热启动 Taq DNA 聚合酶。

6.2.7 10% SDS

分析纯。

6.2.8 20×SSC

分析纯。

6.2.9 去离子甲酰胺溶液

分析纯。

6.2.10 50×Denhart's 溶液

分析纯。

6.3 微阵列芯片

本方法中所使用的微阵列芯片应符合 YY/T 1153要求。

7 样本采集与处理

7.1 采集

7.1.1 全血标本

当上游标本是人全血时，其适用抗凝剂应为 EDTA
或枸橼酸钠等，不得以肝素抗凝；被检者服药情

况、饮食及健康状态不影响标本采集和结果检测。

7.1.2 滤纸干血斑

当上游标本是人滤纸干血斑时，其采集应符合采血常规和管理规范。

7.1.3 口腔拭子细胞

当上游标本是口腔黏膜细胞时，其采集方法应参照常规口腔黏膜细胞采集方法进行。

GB/T 35029—2018

7.2 基因组 DNA 提取

7.2.1 全血标本

对血液标本，DNA
提取以新采集血液为宜，应采用血液核酸提取试剂盒进行基因组 DNA 提取。

7.2.2 滤纸干血斑

对滤纸干血斑标本，用打孔器取若干个干血斑，应采用干血斑核酸提取试剂盒进行DNA
提取。

7.2.3 口腔拭子细胞

对于标本是口腔黏膜细胞时，应采用口腔拭子细胞核酸提取试剂盒进行DNA
提取。

对于其他类型样本，宜采用适宜的处理方式。

7.3 保存

7.3.1 全血标本

血液的保存：采集的血液在2℃~8℃保存不应超过一周；
一20℃保存不应超过一个月。

7.3.2 滤纸干血斑

滤纸干血斑保存：室温干燥保存不应超过1年。

7.3.3 口腔拭子细胞

口腔拭子保存：采集的口腔拭子应尽快检测；需要保存时，应室温干燥后密封保存。

7.3.4 基因组 DNA

基因组 DNA 的保存：待测标本在2℃~8℃保存不应超过一周；
-20℃保存不应超过一个月；

一80℃可长期保存。避免反复冻融。

7.4 运 输

7.4.1 全血标本

血液的运输宜采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

7.4.2 滤纸干血斑

滤纸干血斑宜晾干后密封进行常温运输。

7.4.3 口腔拭子细胞

口腔拭子宜晾干后密封进行常温运输。

8 操作方法

8.1 核酸提取

可使用各种经过验证不影响后续检测步骤的提取方法。提取后，将所得 DNA
采用荧光分光光度

计进行定量。若采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进行检测时，需将 DNA
稀释至试剂盒检

GB/T 35029—2018

测浓度范围。

8.2 检测

8.2.1 配制 DNA 扩增反应体

将水、PCR 缓冲液、引物、dNTP、MgCl₂ 、Taq DNA
聚合酶等按照一定比例混匀，即成 PCR 扩增体

系。本步骤也可采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进行扩增体系的配制。本标准中所说常见

遗传性耳聋相关基因位点见表1。

8.2.2 加入待检测样品

配制好的扩增体系中加入被检测的基因组 DNA 作为扩增模板，放入 PCR
扩增仪中进行PCR 反

应；为监控实验过程是否正常，在该步骤中宜平行加入阳性对照品和阴性对照品进行同步扩增反应。

8.2.3 扩增反应

将加入模板的扩增体系置于 PCR 扩增仪中，设定热循环程序，进行 DNA
扩增反应。 PCR 反应程 序可设置为：95℃预变性5 min;95℃ 热变性30 s,50℃~60℃
退火30 s,72℃ 延 伸 1 min, 重复 35个～40个循环；72℃延伸10
min,结束反应过程。如采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进

行检测，扩增反应程序按试剂盒操作说明书进行。

8.2.4 芯片杂交

8.2.4.1 杂交反应混合物的配制

将一定量的去离子甲酰胺、10% SDS、20×SSC、50×Denhart's
溶液、纯化水，按照去离子甲酰胺 25%～40%、1%SDS、2×SSC、5×Denhart's
的终浓度按比例混匀配制成杂交缓冲液。取适量杂交缓
冲液与8.2.3扩增后的产物混合，配制成杂交反应混合物。杂交反应混合物中杂交缓冲液与扩增产物

混合的比例可采用2:1。

8.2.4.2 杂交反应

在芯片上加入杂交反应混合物。每个微阵列限加一份相应的杂交反应混合物。记录芯片编号及对
应的样品编号。立即将芯片放入已预热到杂交温度的恒温水浴锅或芯片杂交仪中杂交。杂交温度可采
用50℃~60℃。如采用已获得医疗器械注册证书的等效试剂盒进行检测，杂交温度参照试剂盒操作

说明书设置。

8.2.4.3 芯片洗涤液的准备

根据芯片数量配制芯片洗涤液，芯片洗涤液宜用两种洗液进行，分别为洗液1和洗液2。芯片洗涤
液采用10%SDS 和20×SSC
溶液，根据洗液成分，加纯化水稀释配制而成。洗液1成分为：0.1% SDS、

0.3×SSC; 洗液2成分为：0.15×SSC;
配制后的洗液分别混合均匀后平衡至洗涤温度37℃~42℃。

8.2.4.4 芯片的洗涤与干燥

杂交反应结束后，将芯片取出，进行芯片洗涤。芯片的洗涤可使用芯片洗干仪根据操作说明进行洗
涤；或手工洗涤，手工洗涤的条件为：将芯片放入洗液1,按转数80 r/min～100
r/min摇床摇洗2 min;

再将芯片放入洗液2中，按转数80 r/min～100 r/min摇床摇洗2 min。
洗涤后的芯片干燥后扫描。

GB/T 35029—2018

8.2.4.5 芯片扫描和结果判读

使用微阵列芯片扫描仪和配套的软件进行信号的读取及结果判读，具体方法按照微阵列芯片扫描

仪的使用说明书的方法进行。

9 芯片结果判定

9.1 实验结果成立条件

芯片除了设置各基因位点的野生型和突变型探针外，应设置符合表2规定的质控探针。

表 2 探针名称及含义

阴性和空白对照品的检测结果：应只有QC 和 PC
出现阳性信号，软件提示无检测样品。

阳性对照品的检测结果：QC、PC 和 IC
出现阳性信号，同时相应阳性基因位点出现阳性信号，软件

提示该基因位点阳性结果。

如果其中任何一个对照品结果错误，则同一次实验全部样品结果定为无效。

9.2 结果判定

9.2.1 野生型

芯片上所有基因位点的野生型探针都出现阳性信号，同时所有基因位点的突变型探针都无阳性信

号，表示被检测样品为野生型。

由于芯片并未涵盖与遗传性耳聋相关的全部基因和突变位点，当检测结果为野生型时，还并不能排

除被检测者带有与遗传性耳聋相关的其他基因突变位点。

9.2.2 突变型

芯片上所有基因位点的野生型探针都出现阳性信号，同时有一个或若干基因位点的突变型探针出

现阳性信号，而其他基因位点的突变型探针都无阳性信号，表示被检测样品为杂合突变型。

芯片上基因位点的野生型探针出现阳性信号，但有一个或若干个基因位点的野生型探针无阳性信
号，同时对应的这一个或若干基因位点的突变型探针出现阳性信号，而其他基因位点的突变型探针都无

阳性信号，表示被检测样品为纯合突变型。

9.2.3 异常结果处理

如果检测结果异常，建议对样品进行复检。如复检结果仍异常，则可推测该样品存在未知的不被检

测的基因突变位点。

延伸阅读

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